将军家
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德川茂茂（徳川 茂々（とくがわ しげしげ），Tokugawa Shigeshige）
配音：小野友树、松井惠理子〈童年时期〉（日本）；何志威（台湾）；刘昭文→伍博民→雷霆→招世亮／陆惠玲〈童年时期〉（香港）
演员：胜地凉（台湾配音：黄天佑）
生日：6月22日（巨蟹座） 身高：1.75米（5英尺9英寸） 体重：74千克（163磅）[参49]
江户幕府第十四代征夷大将军。通称“小将（将(しょう)ちゃん）”。13代将军德川定定的外甥、澄夜公主的兄长。在天人介入之后，地位如同傀儡。个性单纯耿直。拥有凛然的面容，优雅的举止，小兵级的生殖器。为人光明磊落，气质高贵，十分为人民著想，即使身为敌人的桂也对他相当敬佩。
松平片栗虎仿佛取代过世父亲的地位，但事实上更像一名损友，常带他离开城堡往各处游玩。然而，不论他去夜总会、游泳池、理发店还是滑雪场，只要遇到万事屋等人，常常落的只穿三角内裤，甚至裸奔的下场。在日常篇只要有他的出场，基本都是精品中的精品。
与服部全藏、猿飞菖蒲为儿时玩伴，为了保护影丸自己也受了伤，遂留在了伊贺村养伤半年，顺便习得一些手里剑投掷之术。有一个感情很好的妹妹，在中毒后最后一刻还心系妹妹，并作为一个普通的哥哥去见妹妹最后一面。
《倾城篇》中被银时踢的罐子击中昏倒，后在万事屋杀入城堡时展现出将军的气魄，带领整个警察组织讨伐定定，[参50]最后因自认无法阻止定定是自己的过失而宣布退位，但因幕府高层慰留而复职。[参50]
《告解篇》中因各种神奇遭遇失忆而加入了桂一派，甚至成为一个非常优秀的攘夷志士。实际上并没有失忆并尝试从内里分化桂一派但亦被桂所察觉，二人互相试探斗智之下俱颇为欣赏对方。二人因此亦立下若果对方不在，会替对方使江户成为更好的地方的协议。
在《将军暗杀篇》被服部全藏斩首，后证实死者为真正的影武者影丸，实际上本人早就被带走至伊贺村潜伏在百地乱破的忍者里。即使如此，他还是被高杉和神威的人追杀。在众人保护之下，他成功逃至天皇所在地，打算为日后东山再起准备时，遭其友人背叛下毒，最终在妹妹微微公主的膝枕中平静离世。
角色源自于德川幕府的第十四代将军德川家茂。
澄夜公主（そよ姫（そよひめ），Soyo Hime）
配音：广桥凉（日本）；郭馨雅→蒋庆妍[参1]〈剧场版3〉（台湾）；曾佩仪（香港）
生日：7月16日（巨蟹座） 身高：1.56米（5英尺11⁄2英寸） 体重：40千克（88磅）
将军的妹妹。终日生活在天守阁中，非常渴望见识外面的世界。因此从城里跑出来，在歌舞伎町遇到神乐并且愉快地一起吃醋昆布、逛街、拍大头照等，游玩了一整天，跨越悬殊的身份差距建立起了深厚的友谊。后在傍晚被寻找她的真选组找到并带回。[参51]。有著鲜为人知的另一面—个性腹黑、有著抖S性格的人，有时候会一脸天真的说人令旁人不寒而栗的话。她与神乐、今井信女被志村新八合称为“女版抖S三人组”。[参52]曾与总悟合谋惩处装病的神乐。
《倾城篇》中协助坂田银时等人进入江户城，而她跟神乐的关系这才被银时等人知悉，被银时戏称两人关系完全像海蒂和克拉拉。当万事屋等人被捕后以睡不著为由进入监牢，并告诉了他们六转舞藏的故事。
《将军暗杀篇》再登场，为茂茂泡的茶被人下毒，随即被猿飞给打烂。与茂茂到松平家避难，之后进行逃走计画时被神威等人追杀。在冲田总悟与神威对战时藏到安全地方，避免自己在战斗过程成为累赘，后被转移到安全地方。大战之后和茂茂离开大家。在茂茂中毒该日为其泡茶时打碎了茶具，结果，茂茂在其腿上安详死亡。
《银之魂篇》里再次出场并与幕府众臣商讨对策，曾与喜喜通讯，并与之约定在茂茂之坟前拜祭。在地球保卫战之后，与松平片栗虎扶持信女成为警局总长。在桂自导自演被暗杀之后，接替其管理国家。
正史中家茂没有妹妹，推测澄夜公主的原形应是家茂的正室--和宫。
德川定定（徳川 定々（とくがわ さださだ），Tokugawa Sadasada）
配音：岐部公好（日语：岐部公好）〈第179话〉→土师孝也（日本）；张炳强（香港）
第13代将军（茂茂的前任将军），20年前接替因天人来袭病倒的第12代将军，并重整岌岌可危的幕府。是第14代将军德川茂茂和澄夜公主的伯父，早已从将军之位退下，但仍有极高的权威。
《倾城篇》中透露，定定执行宽正大狱时肃清了大批的攘夷志士，坂田银时、桂小太郎、高杉晋助的老师吉田松阳也在当时因聚集教导小孩子念书而被视为随意组织党派而被肃清，但定定本人并不记得此事。
而后虽已从将军之位退下，但定定为了巩固自己的地位，派刺客于幕府中暗杀异己，后来更在坂田银时等人在将军府的期间，派人刺伤异三郎并企图嫁祸于银时，后来更动手砍断六转舞藏右臂。
银时等人在狱中，从薇薇公主口中得知定定过去将铃兰作为自己夺权的道具，利用完毕后就将她囚禁于吉原，而期间还因发现六转五藏与铃兰的恋情和约定，而斩断五藏的左臂等过去的种种劣行后，便决定起身讨伐他。在《倾城篇》的最后，定定被动员了幕府所有警察机构的茂茂讨伐，被囚禁在监狱，而在狱中被想帮吉田松杨老师报仇的高杉给杀害。
角色源自于德川幕府的第十三代将军德川家定。
德川盛盛（徳川 盛々，とくがわ もりもり，Tokugawa Morimori）
配音：白石凉子（日本）；谢洁贞（香港）
将军的侄子。小屎丸原来的主人，知道小屎丸和九兵卫的感情后将小屎丸送出。
一桥喜喜（ひとつばし のぶのぶ）／德川喜喜（とくがわ のぶのぶ）
配音：浪川大辅（日本）；张方正（香港）
一桥派领袖。原本目的是推翻天导众控制下的幕府，并希望建立一个不须要天人支持而可以与天人对抗的国家。一开始由于有著共同的敌人而与高杉及神威等结盟。[参53]麾下家臣深入幕府政权，定定死后在幕府里已无大敌。
曾被神威、银时、万斋先后重拳击中面部。
《死神篇》最后遭池田夜右卫门背叛，对夜右卫门的背叛感到不解因而大怒并将其枭首。
《将军暗杀篇》与高杉和神威设局在茂茂赴京途中进行暗杀。然而，为了报复不听话又利用他的高杉和神威，又把二人出卖给天照院奈落。最后茂茂虽然没死，但天导众仍将喜喜任命为第15代将军，继承为德川宗家家督。其后，策划了暗杀茂茂的计划并成功。
《再见了真选组篇》里把大权交给见回组的佐佐木异三郎，下令拘捕真选组的松平和近藤。在黑绳岛事件之后，发现被所有身边人利用而感到非常愤怒。
《烙阳决战篇》因一时意气追截银时一众结果反被擒住，众叛亲离之下意识到自己从来都是被人操控的棋子。在与范堺对战时被坂本辰马和陆奥所救，在与之结交的过程中心思有所改变，最后决定亲自前去与解放大军谈判。[参54]
《银之魂篇》透过谈判成功暂缓了天人和地球人的争斗，但圆翔皇子的发难使谈判再次破裂。追随辰马、桂和高杉杀入解放军内部并见证众人成功击败圆翔。当圆翔被部下射杀时，被贯穿其身体的子弹打中身亡，弥留之际勒令所有人停火，灵魂被茂茂接走。
角色源自于德川幕府的末代将军德川庆喜。
警察厅
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松平片栗虎（松平 片栗虎（まつだいら かたくりこ），MatsuDaira Katakuriko）
配音：若本规夫（日本）；黄天佑〈第一季其之壹〉→陈幼文〈第一季其之贰起、剧场版3〉（台湾）；陈曙光→林国雄→陈永信（香港）
演员：堤真一（台湾配音：曹冀鲁）
9月9日出生，处女座。57岁。身高168cm，体重64kg。[参55]
直属幕府的警察厅长官，为真选组的直属上司。受将军信赖，被组员尊称为松平大叔。击溃威胁江户治安的存在的手段比恐怖分子更加激烈，素有“破坏神”的称号，也因此受到包括桂在内的部分攘夷志士的敬重。总是带著一把枪，一有不顺心的事情皆以暴力解决。
常常叼根烟，戴著浅色墨镜，外表冷酷，也常说出可怕的话，虽然让人烦感，但其实是个很怕肉麻的好长官跟好爸爸。每当说“数到三就要xxx”的时候往往数完一就动手了，而且都是以“男人只要知道1跟就能活下去了。”一话带过。
宠爱女儿栗子，对任何有意亲近女儿栗子的男性，都会使用狙击枪将其驱离。甚至不惜动用真选组人员。[参56]为酒店常客。经常带德川茂茂外出，与家臣相比更像是茂茂的损友大叔，但每次外出都导致茂茂被欺负。
《倾城篇》中奉茂茂之命率领全江户的警察包围江户城，威胁城内的卫队在三秒内清出一条路，不然就用大炮轰掉天守阁，想当然尔数到一就下令开炮了。
《将军暗杀篇》里带领大批援军在最后关头来到，成功保下茂茂；在结束时跟茂茂去到京都，在他被袭击后极力想救回他，但失败。
在《再见了真选组篇》中，被喜喜辞官，与近藤遭到逮捕。之后在黑绳岛之战中，成功脱离包围圈，乘坐飞船撤退。
《银之魂篇》与真选组一起回到江户对抗天人大军；大战之后回到政府辅助微微公主。
角色源自于幕末会津藩藩主兼任京都守护职的松平容保；名字“片栗虎”为太白粉的日文名称“片栗粉”之谐音。
真选组
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幕府反恐特殊部队所属的武装警察，成员基本都是无背景的草根武士，8月18日设立。可以直接处置恐怖份子，组员须遵守内定的局中法度，有时被称为“幕府的走狗”。屯所估计位于歌舞伎町。[注2]组织原型为新选组。
近藤勋（近藤 勲（こんどう いさお），Kondō Isao）
日本配音：千叶进歩／国立幸（童年时期）／高桥智秋（性别转换篇）
台湾配音：黄干师
香港配音：陈廷轩、叶振声（代配）→陈欣／吴羡婷（童年时期）／黄玉娟（性别转换篇）
演员：中村勘九郎（台湾配音：曹冀鲁）
生日：1827年9月4日（28岁〔动画版29岁〕，处女座）、身高：1.84米（6英尺1⁄2英寸）、体重：80千克（176磅）、血型：A型、出身地：武藏国[注3]、绰号：大猩猩（ゴリラ）。
真选组局长。外表特征是留著深褐色上扬的头发，下巴蓄著些许胡须，隐私部位毛发尤其旺盛。经常相亲失败。虽然粗线条，但领导能力强，人格魅力大，很重义气，深得队员们信赖。据土方所言，真选组内有许多成员都是因为敬重近藤勋，才加入真选组。被土方形容为真选组的灵魂。
不时会全裸登场，认为男人就是要“坦荡荡”。是公认的“跟踪狂”（和猿飞菖蒲对银时一样）。喜欢志村妙[注4]，常常会出没在有志村妙场景的衣橱或者桌子底下。一厢情愿将新八视为弟弟，并装熟称他为小舅子。
小时候不知何事而被赶出道场，后偷别人家的萝卜而被绑起来，被人称是猴子的小孩。后神父（猿吉小僧）收留，但神父被卷入了高利贷而被夺走了小孩和神社的土地，他便率领剩下的小孩一起夺回来，不过神社却也被烧光了。后来与门下生土方、总悟等乡下武士向应松平的号召到江户打拼，组成现今的真选组。
初登场时对妙死缠烂打，为了应付他妙只好著银时假装是她未婚夫。为了争夺妙，近藤向银时宣战，但却被银时坑了。即使如此，他依然没有放弃对妙的追求。
《九兵卫篇》为救志村妙联同新八一起杀入柳生家发起挑战，在厕所心理战中突围而出打赢东城步，但也力尽而倒下。救回妙之后他原本要被逼与女猩猩结婚，还是妙出手把他救走。
《真选组动乱篇》中没有听取土方的意见重用了伊东鸭太郎，结果果然被其出卖；在土方和冲田以其他忠于他的队员努力之下保住性命，继续出任真选组组长。
《歌舞伎町野猫篇》中桂、银时与近藤勋在一座古庙的猫墓里放出排泄物，被诅咒变成大猩猩，不知所措的情况下，只好跟著有歌舞伎町野猫王之称的芳一；连场混战之后，顺利解除了诅咒。
《性转换篇》变成与男儿身不同的金发巨乳美女，说话语气也变得委婉，但仍有随地大小便的习惯。
《灵魂转换篇》阿银跟土方交换灵魂之后，真选组被土方（阿银）搞成像《北斗神拳》的飞车爆走团，自身也成为莫西干男。
《倾城篇》里偷偷放走了银时一行人；后面跟随茂茂的指挥之下杀入江户城内，逼走定定。
《将军暗杀篇》里真选组接到密令，要护送将军暂离江户至京都；真选组大部分人留在京都保护其中一位假扮将军的影武者，而留下近藤跟土方护著由银时假扮的将军。在途中合力收拾了叛变的藤林铠门及其手下的伊贺忍者们。后高杉跟神威举兵入侵伊贺的忍者村庄，近藤与土方联同百地乱破为万事屋和将军断后，阻挡春雨战士的攻击，身负重伤。
《再见了真选组篇》因护送前任将军德川茂茂失败，被现任将军一桥喜喜革职，在与银时喝完诀别酒后，被今井信女逮捕。在狱中与桂一同逃走，在黑绳岛中大战佐佐木异三郎。因为奈落的介入，听从佐佐木的计谋假死并杀出一条血路。此事之后，真选组已等同于灭亡，桂小太郎劝他们尽早远离江户，以利日后东山再起，这时候志村妙对近藤的关系已经缓和。
《银之魂篇》中银时、新八、神乐、信女等陷入危机时，率领真选组出场救援四人，并参与和虚的大决战之中。两年之后原计划与猩猩国公主和亲但逃出时令其太空船撞向天导众的太空船使之撞回江户。回到地面后与真选组员们重聚，并再次指挥大队支援万事屋等人攻入能量塔。结局里，他回到警局里继续任职。
角色源自于新撰组局长近藤勇。
土方十四郎（土方 十四郎（ひじかた とうしろう），Hijikata Tōshirō）
日本配音：中井和哉
台湾配音：黄天佑（第一季其之壹）→梁兴昌（剧场版1）→何志威（第一季其之贰起、剧场版2～3）
香港配音：黄荣璋→何承骏→关令翘
演员：柳乐优弥（台湾配音：何志威）
生日：1828年5月5日（27岁、金牛座）、身高：1.77米（5英尺91⁄2英寸）、体重：64千克（141磅）、血型：A型
真选组副长，武藏国出身。有“鬼之副长（鬼の副長）”、“真选组的头脑（真選組の頭脳）”之称。
擅长应付组内各种大小问题，而且由于被迫经常夹在上司和部下之间，堪称真选组里的应付达人，在“文通篇”中被称为“认衰方十四王（忽方十四悠，道方十四歉，フォロ方十四フォロー）”。近藤勋称他为阿年（トシ，中国大陆和台湾译作“阿年”，香港译作“十四”），期后神乐也这么叫。
自尊心极重但表面上十分冷酷，为了要保护的东西可以变得非常热血。眼神凶狠，总是烟不离口，被形容为重度的尼古丁依存症。爱用蛋黄酱樽型的打火机。当在江户发出禁烟令期间，专程远赴ハメック星抽烟。喜欢蛋黄酱，经常吃加了大量蛋黄酱的“土方特制茶泡饭（お茶づけ土方スペシャル）”和“土方SPECIAL（土方スペシャル，香港又译“土方士啤苏”或“土方至爱”）”。害怕牙医和幽灵。
是个私生子，母亲死后由同父异母兄长土方为五郎视为亲生儿子般扶养。11岁时家中被劫，为五郎为了保护他而双眼受创，土方受其刺激，持刀杀伤暴徒，从此被害怕他的兄弟称为“荆棘流氓”并离家出走。少年时期常打群架，也因此锻练出优秀的直觉与反射神经，后被近藤勋所收留。与冲田总悟的姐姐冲田三叶互有好感，离开乡下前，三叶曾向他告白，但认为出入于战场上的自己无法带给她幸福而拒绝了三叶的感情。一直将这段情绪压抑着，直到转海屋事件中才说出三叶是他心爱的女人，不过直到最后也没有去见她最后一面。
喜欢看周刊少年《Magazine〔孖加煎〕（マガジン）》，游戏方面则是辩天堂派。
与银时结识是因为其赢了近藤，为了为其报仇挑战银时，但还是被击败。相处下来发觉二人其实多有相像，当共同抗敌时合作无间，但只要见面却总在吵架。
《九兵卫篇》为了支持近藤而与万事屋等人挑战柳生一族，与九兵卫对决时感应到对方为女子而不想出刀。
《真选组动乱篇》动乱爆发前因旧刀磨损而去打磨，在锻造处借替代用刀“村麻纱”，随即被刀上附身的怨灵诅咒，人格异变，变成一个无心工作、爱好收集美少女模型、个性懦弱的秋叶原系御宅族宅十四（トッシー），会在其他人的称呼加上“～氏”。由于违反了多项真选组局中法度而被真选组停职。在意志被吞噬前拜托万事屋保护真选组。后来因银时等人的协助以自己的精神力压制怨灵，回到真选组。然而，宅十四的人格仍旧存在且影响他的生活，直到《宅十四篇》后土方才成功从村麻纱的束缚中解放。
《蔷薇流氓篇》协助佐佐木铁之助融入真选组，并与银时里应外合，使佐佐木异三郎颇为狼狈。
《性转换篇》中因为之前身为男性时摄取过量蛋黄酱，在变成女性时导致身体暴肥，被近藤和总悟称做“猪排”。化名为“土方Ⅹ子”。基本上除了变得很胖、多了胸部及双辫子之外跟原本没有差别（包括声线）。
《灵魂转换篇》银时跟土方交换灵魂之后，把银时积欠的薪水和房租全部缴清，并对万事屋实行纪律管教，甚至吸收了桂小太郎、以长谷川为首的游民以及以猿飞为首的部分御庭番众，成立“万事屋番队”，口号是“恶•即•斩！”。
《将军暗杀篇》与近藤护送银时一行人，与茂茂重遇后拼死保护其安全，并与百地乱破一起阻档春雨和高杉合军。
《再见了真选组篇》因近藤遭到逮捕，真选组名存实亡，而转到捕快小钱形手下。后在众人的鼓励下继续带领真选组，跟银时联手前往黑绳岛营救近藤和桂，跟见回组打得不可开交，最后被奈落的军队突袭，伤亡惨重，两方人马不再恋战退出战场。最后与近藤一起彻出江户。
《银之魂篇》再次出场跟近藤阻档天人的进攻，并参跟虚的大战。地球保卫战结束两年后再次做回捕快，但实际上在暗中监视银时等人。当天导众太空船撞落地球后，与近藤汇合攻入能量塔，协助银时等人打败天导众及虚。在结局里，再次回到真选组任职。
与战国BASARA中的伊达政宗同为中井和哉配音，常被他人以此戏弄。
角色源自于新选组的副长土方岁三。
冲田总悟（沖田 総悟（おきた そうご），Okita Sōgo）
日本配音：铃村健一／冈本奈美（日语：岡本奈美）（童年时期）／伊藤静（性别转换篇）
台湾配音：黄干师（电视版、剧场版1～2）→孟庆府[参1]（剧场版3）／郭怡心（童年时期）
香港配音：张裕东／何璐怡（童年时期）／凌晞（性别转换篇）
演员：吉泽亮（台湾配音：魏德）
生日：1837年7月8日（18岁、巨蟹座）、身高：1.70米（5英尺7英寸）、体重：58千克（128磅）、血型：B型
真选组一番队队长。组内首屈一指的天才剑术高手，但较常使用枪械及大炮。外表清秀，但为人阴险腹黑，为本作最标青的超级抖S；不过某程度上有相当强的正义感。武藏国出身。
觊觎副长之位，常做出恶搞乃至试图杀害土方的举动，譬如以大炮瞄准土方、或对其进行诅咒仪式，甚至栽赃土方等。对近藤他倒是极为忠诚。与姐姐冲田三叶相貌相似，感情很好。对从小失去双亲的他来说三叶有如母亲一般的存在，对姐姐唯命是从。
自赏樱大会后，每次和神乐见面就会吵架甚至大打出手，被神乐嘲讽：“这小子绝对喜欢我。”然而，当利害关系相同时还是会好好合作。
幼年时已经是天才，被道场的人喜爱。自从土方十四郎到来之后抢走所有人的目光，加上姊姊对土方怀有爱慕之情，令他觉得自己重要的东西都被土方抢走的感觉。面对土方拒绝三叶的表白，总悟虽然理性上知道土方的难处，但却始终无法释怀其冷酷无情。曾说近藤、土方和银时都是他人生难得能遇上的损友。
《三叶篇》中拉拢银时去骗自己姐姐三叶为自己好友，也要求土方可以对三叶的未婚夫网开一面，被拒绝。在结尾支援土方，并赶回来见证三叶的死亡。
《真选组动乱篇》时为了副长的位置投靠伊东一派，但当知道其想杀掉近藤时倒戈，一下子砍倒一车的叛党，但也力气用尽而倒下。
《六角篇》中在街上被少女突袭，为了保护她和其父声誉而委托万事屋插手事件，但结果真选组员们还是以个人身份支援，打倒了一众乱来的攘夷志士。
《两年后篇》被疣寄生，并成立了“神圣真选组帝国”，自称总悟·抖S·冲田三世（真选组皇帝（カイザー）ソーゴ・ドS・オキタIII世），人称笨帝（バカイザー）。[注5]
《蔷薇流氓篇》里与信女初遇便知道对方都是高手并也是一个抖S，在砍柱子的对决出胜出，但实际上没有真正对她造成伤害。
《将军暗杀篇》和神乐的哥哥神威有过一战，二人招式上不相上下，但总悟还是身受重伤。最后还是成功与同在船上的微微公主平安脱困，并于最后与松平等人赶回去支援茂茂。
《再见了真选组篇》中在跟土方杀入黑绳岛拯救松平和近藤。原本跟信女对决的他被神乐阻止，并遇上了虚更被其打成重伤。在众人的努力下，撤出黑绳岛，并与近藤等离开江户。
在《银之魂篇》里回归对抗天人联军，再次与虚对决。之后桂成功执政并下令总悟切腹，实际上是让他隐藏并迟下里应外合进作假暗杀之计。当天导众残党的太空船降落至能量塔时，伙同真选组攻进能量塔。结局中，回到警局工作。
角色源自于新选组的一番队组长冲田总司。
山崎退（山崎 退（やまざき さがる），Yamazaki Sagaru）
日本配音：太田哲治
台湾配音：贺宇杰（第一季、剧场版1）→马国尧（第二季、剧场版2～3）[参1]
香港配音：李致林
演员：户冢纯贵（台湾配音：黄天佑）
生日：2月6日（32岁、水瓶座）、身高：1.69米（5英尺61⁄2英寸）、体重：58千克（128磅）
真选组监察员，土方的直属密探。兴趣为打羽毛球和卡巴迪。有空档便会打羽毛球而怠忽职守，因此常被土方殴打。
在一开始加入真选组时跟流氓没有两样，自称为“大山杀鬼”，但被近藤等人威慑之下屈服，性格也变得温顺。
外观与行为朴素，有毅力，观察细致，能很容易融入环境中，因此很适合做探子或间谍的职位。进行监察工作时会只吃红豆面包和牛奶以祈求工作进行顺利。
与新八同样有奇怪的上司而相对比较投缘，在赏花大会决斗中和新八一起兼任主持人。在一次监视银时的行动中，喜欢上了住在银时楼下的小玉。虽然知道小玉是机器人，为此万事屋和真选组还曾帮两人相亲。
在《失忆篇》成功卧底Justaway的工厂找到银时和近藤。
《真选组动乱篇》里发现伊东一派的阴谋却被河上万斋重创，及后成功救回。
《人气排名篇》中作为幕后黑手，引导各角色自相残杀去拉高自己的人气排名，虽最后被感化，但仍被众人扔落大厦。
《再见了真选组篇》跟随土方杀入黑绳岛，被奈落的军队弄伤，后被新八救走。
在《银之魂篇》被虚一击打到重伤，但事后却被众人遗忘，本体被当成实验对象保存，意识则传输到一具机器战警上。两年后，依然跟随土方在捕快衙门工作，也参与了最后的大战。在结局里显示肉体已苏醒，并生产出更多机器战警。
角色源自于新选组的监察员山崎烝。
齐藤终（斉藤 終（さいとう しまる），Saitō Shimaru）
配音：樱井孝宏（日本）；李安邦（香港）
真选组三番队队长，也是目前三番队中唯一的成员。是个被人称为“爆炸狼（アフ狼）”而被畏惧的男人。实力不俗，令总悟也敬重的人物，总悟称为终哥。[参57]。以面罩遮住脸的下半部，有著一双毫无生气的死鱼眼，顶著一头蓬松的橙色爆炸头。 外表冷酷，沉默寡言，几乎不讲话，进入真选组的前两年唯一发出的声音也只有打呼声的Z音。然而实际上却是个内心纤细而多愁善感的人，只是因为害怕讲错话才一直保持沉默，结果成了现在这样不善于交际到了极点。常因为交际的压力而跑厕所大便。笑容很恐怖，不但无法拉近与他人的距离，反而还会把对方吓跑。
是过去与近藤等人一同从乡下上京，在真选组成立之前就有交情的友人。在桂企图用真选组的新人采用试验来潜入卧底时，与桂对打了近一个小时也不落下风，后因近藤阻止而打成了平手。有写日记的习惯，但每一句的句尾都有“Z”字。虽然因为对桂的爆炸头与他重复感到不满甚至想杀了他，但碍于三番队人数太少所以作罢。有一本简称为“Z簿”的期望交友对象录，会将想成为朋友的对象名字写入其中。
因为他的沉默而被指派负责真选组的内部侦查，调查并处决背叛真选组的队员。过去三番队除了他以外的其他队员都是违反局中法度或勾结攘夷志士的叛徒，所以全被他一手处决，变成了以尸体堆叠起来的部队，也因此让三番队有了“沉默部队”的称号。实际上这些人会被发现全是因为误会齐藤终想跟他们做朋友的行径，而自己作贼心虚的露出马脚。
《再见真选组篇》里黑绳岛之战中，与伊莉莎白合作无间，打掉佐佐木的配枪，但被“虚”带领的舰队用光炮击伤，最后安然撤出战场并跟大队离开江户。随后在《银之魂篇》再次出场跟队真选组作战。
角色源自于新选组三番队组长斋藤一。[注6]
原田右之助（はらだ うのすけ）
配音：三宅健太（日本）；贺宇杰（台湾）；刘昭文、张锦江〈代配〉（香港）
演员：一之瀬亘（台湾配音：宋克军）
真选组十番队队长，为一名光头大汉。7月6日出生，身高180cm，体重90kg。
角色源自于新选组十番队组长原田左之助。
伊东鸭太郎（伊東 鴨太郎（いとう かもたろう），Itou Kamotarō）
配音：真殿光昭、关山美沙纪〈童年时期〉（日本）；陈幼文（台湾）；刘奕希（香港）
演员：三浦春马（台湾配音：黄天佑）
12月13日出生，22岁，身高175cm，体重68kg。原著第百五十八训；动画第101话初登场。
真选组参谋。为夺取真选组而背叛近藤并和鬼兵队联手，却被鬼兵队有机可趁借此削弱真选组的势力。与其兄鹰久为双胞胎，但母亲却只疼爱体弱多病的鹰久，将他视为累赘，幼年时不被人所重视，导致其孤癖的性格和期望有所作为的欲望。头脑相当聪明，自小被称为神童。尽得“北斗一刀流”免许皆传的人才。
一开始只是为了让母亲的目光转移到自己身上，最后则是要在同侪之中备受瞩目，却只得到反效果。被近藤尊称为老师，甚至近藤一度想让伊东接任真选组局长之位。仇视土方，甚至利用土方持得妖刀后的怪异表现进而迫使他离开真选组。尝试拉拢总悟未果。真正想法其实只是需要同伴，希望有人陪伴。在生命的最后一刻才真正知道自己一直在追求的伙伴一直在身边。之后真选组组员为了不让其背负叛徒污名死去，决定用武士道的对决方式，由副长土方向伊东发起挑战。最后在众目睽睽之下被土方击败，但伊东也真正地了解了追求的东西其实一直都在身边，只是自己的傲视遮住真实的世界。弥留之际被真选组成员重新承认为伙伴，在对他们道谢之后死去。
角色源自于新选组参谋伊东甲子太郎和新选组第一任局长芹泽鸭。
篠原进之进（篠原 進之進（しのはら しんのしん），Shinohara Shinnoshin）
配音：桑原敬一（日语：桑原敬一）（日本）；江志伦（台湾）
真选组监察员，伊东派。12月22日出生，身高170cm，体重58kg。
角色源自于新选组的监察员篠原泰之进（日语：篠原泰之進）。
稻山（いなやま，Inayama）
配音：平野俊隆（日语：平野俊隆）（日本）；贺宇杰（台湾）；梁志达（香港）
真选组队士。曾经在真选组屯所的纳凉怪谈大会，描述过有关“穿著红色和服的女人”的怪谈。
角色源自于日本的知名怪谈专家稲川淳二。
隈无清藏（くまなく せいぞう，Kumanaku Seizō）
配音：楠大典（日本）；马国尧（台湾）；梁志达（香港）
真选组一番队队士。额头上有颗痣，有洁癖。曾为了厕所的事而跟总悟向土方要求改革。
神山五郎（かみやま ごろう，Kamiyama Gorō）
配音：关俊彦（日本）；江志伦（台湾）；叶振声（香港）
真选组一番队队士。曾参与二年前的六角事件，且与冲田队长和四名同队队员联合杀掉攘夷组织“创界党”多数成员，是当年事件的唯二幸存者之一。对总悟很仰慕，甚至有些变态行为。
角色源自于新选组队士平山五郎（日语：平山五郎）。
佐佐木铁之助（佐々木 鉄之助（ささき てつのすけ），Sasaki Tetsunosuke）
配音：伊藤健太郎（日本）；马国尧（台湾）；刘奕希（香港）
来自幕府中人才辈出的名门佐佐木家，却是位不务正业的纨绔子弟，《蔷薇流氓篇》里初登场被受不了的家人丢给真选组托管，担任土方十四郎的小姓。拥有戴上墨镜就长出胡子、摘下墨镜失去胡子的特技，其墨镜之下是一双非常正太化的眼睛。行事采美式嘻哈风，喜欢以RAP方式来叙述或对决。从A Boy（Akiba Boy）进化成B Boy（Breakin' boy）再退化成C Boy（Cherry Boy）。一开始虽然不做正事，但在土方为自己与兄长佐佐木异三郎对峙时受到启发而决定努力上进，让自己能够成为独当一面的武士。在真选组之后的整体出场中都有露脸，并在《再见真选组篇》目睹异三郎坠下飞船；其后跟近藤离开江户，并在《银之魂篇》再次回归。
角色源自于土方岁三的小姓市村铁之助。
见回组
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幕府所属的另一武装警察队，成员几乎都是从名门的子女中精挑细选出来极度有才华之人，职权与真选组相当，与真选组管理的领地无重叠。[参58]组织源自于京都见回组。
佐佐木异三郎（佐々木 異三郎（ささき いさぶろう），Sasaki Isaburō）
配音：森川智之（日本）；陈幼文（台湾）；潘文柏（香港）
见回组局长，习惯自称“小三郎”[参59]。名门佐佐木家长男，铁之助同父异母的哥哥，有“三天的怪物”（拿剑如“二天”，拿笔如“天神”）之称。战斗时使用一支手枪和一把刀，利用手枪射击迫对方避开子弹，再用刀攻击，令对方被迫避开子弹而无法避开刀的攻击。[参58]
有严重的“短信依赖症”，在执行任务时会不断传短信，并且希望对方能快点回复他。[参60]但在过去曾是个手机白痴，打字速度慢得惊人。
是首个提出把武士们收编作幕府用的人物，“真选组”的成立可以说跟他息息相关，当幕府想把真选组作为政治斗争牺牲掉时，其与松平片栗虎合作保下了真选组，却导致天照院奈落派包括骸在内的一众刺客下来杀掉佐佐木异三郎及他的妻女。虽然悲痛莫名，作为精英的他敏锐地洞悉骸并没有杀害自己妻女，反而试图保护她们。事件之后收留了骸并成立见回组，把原本给女儿的名字“信女”给了骸。
虽然在出场时被认为是真选组的敌人，实际上非常欣赏他们；基于之前的经历对幕府的统治并没有信心，认为要改变社会一定要所有东西都被重置，包括腐朽的幕府，以及在它上面天照院及天导众。
明面上将弟弟视为累赘[参60]并将他送入真选组，因此与土方在《蔷薇流氓篇》里对立并发生冲突。[参61]
《倾城篇》中帮助银时等人杀入幕府推翻德川定定的势力。
前将军德川茂茂遭暗杀身亡后，被现任将军德川喜喜提拔为警察厅长官，取代了松平片栗虎的位置。[参62]《再见真选组篇》中故意安排桂和近藤共处同一监狱使二人俱能逃走，并带领见回组引出了幕后的大boss天照院奈落、天导众和虚，并在关键时候与真选组化敌为友，共同抗敌。一行人从黑绳岛撤退时，异三郎为了救信女和铁之助从飞船坠落，死在黑绳岛之役中。[参63]
角色源自于见回组局长佐佐木只三郎。
今井信女（今井 信女（いまい のぶめ），Imai Nobume）
配音：平野绫（日本）；郭怡心（台湾）；张颂欣（香港）
原见回组副长，在佐佐木异三郎死后独自行动[参59]。。生日：1835年10月8日（20岁、天秤座）、身高：1.65米（5英尺5英寸）、血型：O型
黑发（动画是绀色）姬发式暗红色眼的少女，有著杀手眼神。其性格冷漠淡然，有著跟冲田总悟一样的抖S性格，与神乐和微微公主被新八合称为“抖S女子三人组”。携带长刀，其实是刀鞘尾端另藏一把刀，碰到难缠对手就会改为二刀流。
喜欢吃甜甜圈，曾被佐佐木异三郎用甜甜圈从废墟中钓出。另外有著模仿他人声音的特技。
曾为奈落的一员，过去是曾被称为“死神的私生子”的神童，与胧并称奈落三羽，代号为骸，后颈有八咫鸟的刺青。在担任狱卒时曾拜松阳为师并且习字，是以对他其他学生颇有兴趣。在刺客时期曾试图援救异三郎妻女，但没有赶上。之后异三郎没有杀她，约定二人互相为仇敌并与仇敌活下去；信女的名字就来自于佐佐木为未出生的女儿所起的名字。自此，她对异三郎一直十分忠心。[参64]
《蔷薇流氓篇》时曾和冲田在旧大楼中一对一单挑，并砍断了许多水泥柱，但最后被其所打败并埋在废墟中，接著佐佐木异三郎将她从废墟里用甜甜圈钓出来。
《再见了真选组篇》逮捕了真选组局长近藤勋，在黑绳岛大战中再次受伤。在结束时亲眼看见异三郎的消失而悲伤不已，在甲板上用手机写下最后的简讯后将手机朝天掷出，与慢一步到场的近藤与其他真选、见回组伤员向异三郎敬礼致敬，眼中透出了未曾出现的光芒。（简讯的内容为“异三郎，谢谢你给我这么棒的名字。”）[参65]
《烙阳决战篇》找到银时并告诉银时一众人很多关于银时过去的老师吉田松阳（虚）的真实身份和真相，自称亦是松阳的徒弟。带领来岛又子求助万事屋一起去救援晋助。[参66]
在《银之魂篇》中把公主交托给六转舞藏之后加入战斗，对抗天人入侵。两年之后成为新任警察厅长官，暗中保护真选组等人进入江户，并在最后之战中加入支援万事屋的行列。
角色源自于曾参予杀害坂本龙马的今井信郎，长相可能参考日本著名女演员栗山千明。
御庭番众
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过去服待将军及幕府的忍者团队“御庭番”。
服部全藏（服部 全蔵（はっとり ぜんぞう），Hattori Zenzō）
配音：藤原启治〈电视动画〉→森川智之〈剧场版3〉、熊井统子〈少年时代〉（日本）；贺宇杰〈第一季〉→陈幼文〈第二季〉→何志威[参1]〈剧场版3〉（台湾）；陈永信／黄丽芳〔童年〕（香港）
生日：8月22日（狮子座） 身高：1.75米（5英尺9英寸） 体重：59千克（130磅）[参67]
被称为“摩利支天（まりしてん）”的忍者，原御庭番众的精英，猿飞菖蒲的前同学及头领。伊贺三大忍者家族中的服部家的现任当家。曾为幕府效力，现在是自由身，忍法在出过场的伊贺忍者里数一数二。对自己的能力很有信心，同时认为自己作为忍者并没有尽忠之人，为的只是利益。然而在后面当要在利益和情谊之间选择时，其毫不犹豫地选择了后者。
空知英秋原本计划在《将军暗杀篇》将他写死，但后面又改变主意，称是“因为猿飞太努力”之故。
父亲号称是“御庭番最强的男人”，亦是现在活跃于江户的忍者之恩师，因为其贪玩的性格，令全藏觉得父亲总是为他人带来麻烦。
超级漫画迷，与银时争购JUMP而结下梁子，称银时为“Jump武士（ジャンプ侍）”。患有严重痔疮，身受其苦，因此全藏的搞笑剧情多与痔疮有关。被神乐称为“痔疮忍者（イボ痔忍者）”。喜欢丑女，曾说过:“比起高楼大厦（美女），我更喜欢废墟（丑女）。”[参68]
小时候与德川茂茂和猿飞菖蒲等一同受训，把对方都视为朋友。御庭番众在幕府被天人控制后被逼解散，他成为自由业忍者后，接了不少奇怪的活，如替邪教教主服务，又或替幕府官员诱抓桂，以及保护天眼通阿国等等。当中他与银时时而对决时而合作，因而与万事屋等人逐渐熟络。
《红蜘蛛篇》中当银时被地雷亚打成重伤丢进海里之后将他救起送回吉原，并揭露地雷亚的真正身份。当银时率众前往营救月咏时，为其解决一大群小喽啰。
《后宫篇》联同一众女角整蛊银时，以逼使其立定决心去戒酒。
《眼镜篇》中为了保护猿飞被万事屋等人使用其屋子对抗忍者杀手们，但结果自己家也遭到不小的破坏。
《将军暗杀篇》里为了保护好友茂茂精心策划了三重计谋：一早带走茂茂往伊贺村并在江户安插多个分身分薄对手兵力、在六转舞藏前把自愿的替死鬼影丸斩首扮作出卖茂茂、联合百地乱破引出并杀死内奸。孤军深入的他一人奋战整队鬼兵队，击倒多名敌人，但自己亦身受重伤。在快被鬼兵队围攻至死时，猿飞率领其他御庭番众将之救下，并带其去到出口。不过，在那里二人被高杉及神威伏击，猿飞被捅至重伤。危急之际全藏再次出手，救下猿飞之馀以苦无雨拖住众人，并亮出了自己的最后王牌 - “万事屋三人组”。随著喜喜出卖高杉和神威与天照院奈落大军杀到，事情也已脱离他的计划，不过茂茂还是安全地离开战场回到京都。
《再见了真选组篇》得知茂茂之死后感到非常悲伤，认为自己愧对影丸以及茂茂，是一个罪人。因之前身受重伤全篇基本下线。
《银之魂篇》里再次出现保护微微公主，原想送她离开地球，却被其留下的决心所影响，回到猿飞身边与其一同率领御庭番众对抗天人大军。在地球保卫战中作为战力、打探情报并参与战前计划。此战胜利之后，再次与众人不辞而别。两年后天导众飞船下坠后，回到江户与猿飞共同行动，攻入能量塔中支援银时。
角色源自于安土桃山时代德川家康的家臣服部半藏。
猿飞菖蒲（猿飛 あやめ（さるとび あやめ），Sarutobi Ayame）
配音：小林优、兴津和幸〈性别转换篇〉（日本）；郭馨雅、吴佳桦[参1]〈剧场版3〉（台湾）；曾秀清→陈皓宜[注7]、杨善谕（代配）、邓港文〔性别转换篇〕（香港）
演员：夏菜（台湾配音：傅其慧）
出生6月2日（双子座） 身高：1.69米（5英尺61⁄2英寸） 体重：52千克（115磅）[参69]
通称小纱（さっちゃん，中国大陆和台湾译作“小纱”，香港译作“小幸或幸幸”，又译作“小猿”）
紫色长直发，右眼角有一颗泪痣。严重近视，没有眼镜就甚么都看不清，但凭借天份以及懂得运用其馀四感弥补先天不足，加上配戴的伊贺特制眼镜，仍能成为江户一流的女忍者。拥有令贫乳神乐羡慕的丰满上围，是本作中数一数二的巨乳眼镜娘。亦是著名的残念美女（残念な美人）。
原御庭番众的精英，现为自由身雇佣杀手。擅长使用自己爱吃的纳豆进行攻击，自创忍术“纳豆束缚”。
任务中偶然闯入万事屋，迷恋上坂田银时，其跟踪狂的程度绝对不亚于近藤对阿妙，经常可以在假天花﹑地板下﹑衣柜，甚至电视机之内发现她的踪影，坂田银时等人对此亦已经习以为常。而潜藏的M属性亦在遇上坂田银时后随之觉醒，每当面对坂田银时便会不期然化身成“抖M”，因此会被对方称作“母猪（メスブタ）”或“女色魔”﹑而本人对于这些称呼亦相当受落，甚至还会以“母猪”自居。但跟坂田银时和冲田总悟（♀）以外的人相处时则与普通正常人无异，甚至还会显露出“抖S”的一面。视阿妙为情敌，两人经常有恶言与肢体冲突。
虽然经常遭到银时藐视，但紧急关头还是非常相信她的能力。很在意月咏在人气排名中位置比自己高，但与月咏似乎因同为忍者的关系而成为朋友。
《忍者篇》训练万事屋和桂等人去对抗自己之前的队友，对决以全藏为首的五人组。
《眼镜篇》中银时因弄坏了她的眼镜却买了一副完全不适合她的眼镜弥补结果任务出错差点被忍者处理队解决，但在全藏和万事屋的帮助下化险为夷。
《人气投票篇》中是众主要女角色里排名最低，但仍与妙、月咏、九兵卫等人组成Diamond Perfume队伍以拉高自己排名。此队伍在《HDZ48篇》再次登场帮助寺门通对抗天人偶像团。
《性转换篇》变成与一个稳重冷静的美男子（但在本质上仍是变态抖M），帮助银子破坏摄影机与入侵凹凸教的根据地。
《灵魂转换篇》银时跟土方交换灵魂之后，被银时(土方)严加管理，自身也成为“万事屋五番队队长”，旗下成员皆为忍者。
《将军暗杀篇》中率领御庭番众保护将军，救下全藏之后一直在奋战之中，直至被高杉捅至重伤。大战后成功安全回到江户但仍改变不了茂茂被杀的命运。
《银之魂篇》再次出场和全藏和其他忍者一起对抗天人联军。地球保卫战之后因全藏又一次消失接管了御庭番众并成为其首领，公器私用发动所有忍者找寻银时，以求跟之结婚。两年后当星芒教太空般又撞入能量塔时，再次协助万事屋等人对抗虚。
姓氏源自于真田十勇士之一的忍者猿飞佐助。
全藏的父亲（全蔵の父）
配音：西村知道（日本）；陈幼文（台湾）；林保全→张炳强（香港）
生日10月21日（天秤座）；身高157米（515英尺1英寸）；体重43千克（95磅）。
动画第48话初登场，已故。幕府里最强的忍者。样子总像在笑，性格乐天，生性贪玩，一年到头都在处游玩，曾为全藏带来过不少麻烦。号称是“庭番最强的男人”，亦是现在活跃于江户的忍者之恩师。最喜欢玩踢罐游戏，甚至在过世之时都以“灵体”形式与偶然路过的万事屋一行玩了一次。
《红蜘蛛篇》里被全藏回忆，曾经以将军的影武者身分挡下地雷亚的刺杀。
胁薰（脇薫（わき かおる），Waki Kaoru）
配音：新井里美（日本）；曾允凡→吴佳桦（台湾）；许盈→谢洁贞（香港）
忍者，被称为“辩财天”。本名玛丹娜胁薰，讲话恶毒，能使出咒缚旋花（凡是闻到毒玫瑰香味的人将无法动弹），但被猿飞菖蒲的纳豆臭味破解，最后被猿飞菖蒲拿纳豆砸脸而败。有开一家花店。《暗杀将军篇》中参与保护茂茂。
刚（ごう，Gō）
配音：羽多野渉（日本）；林协忠（台湾）；雷霆（香港）
忍者，被称为“韦駄天”。会使出分身之术，但本尊的情况不会显现在分身上，被新八看穿而打败。《暗杀将军篇》中参与保护茂茂。
修轮（しゅわ，Shuwa）
配音：江川央生（日本）；贺宇杰（台湾）；招世亮（香港）
忍者，被称为“毘沙门天”。会使出怒品愚（能类似户愚吕使肌肉膨胀），但鼓错地方，被新八打败。《暗杀将军篇》中参与保护茂茂。
松尾（まつお，Matsuo）
配音：松尾贵司（日语：松尾まつお）（日本）；黄干师（台湾）；冯锦堂（香港）
忍者，被称为“广目天（広目天，こうもくてん）之松尾”。擅长计算，被新八跟桂打败。名字取自于著名俳句大师松尾芭蕉。《暗杀将军篇》中参与保护茂茂。
才藏（才蔵（さいぞう），Saizō）
配音：大冢明夫（日本）；陈幼文（台湾）；潘文柏（香港）
4月9日出生，身高176cm，体重67kg。[参70]
忍者。对他而言，全藏就等于痔疮的存在。在《天眼通篇》出场并被全藏打败，之后便没有再现身。
角色源自于著名忍者雾隐才藏。
影丸（かげまる，Kagemaru）
配音：小野友树（日本）
御庭番众的一人，影武者，从小就与茂茂、全藏、小猿一同训练，小时候被抓走几乎被幕府牺牲掉，但在茂茂等人营救之下捡回一命。于《将军暗杀篇》为了保护将军而自愿被全藏给砍下首级，以欺骗天下将军已死。
柳生家
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代代侍奉幕府的名门家族，使用“柳生陈阴流”的剑术流派，有众多门生前来习剑；而“柳生四天王”为柳生家服侍的门生里面实力最强的四人。四人的名字都是参照《草莓100%》的四位女主角的名字。
柳生九兵卫（柳生 九兵衛（やぎゅう きゅうべえ），Yagyū Kyūbee）
配音：折笠富美子（日本）；郭馨雅（台湾）；陈凯婷→曾秀清[注8]→陆惠玲[注9]（香港）
4月20日出生，17岁。身高157cm，体重45kg。[参71]
侍奉幕府之名门剑豪柳生家的千金暨下任当家。因母亲生产后去世，家族又习惯让男孩当家，父亲和祖父决定将她当成男孩扶养（若是续弦生了儿子，九兵卫为长女则在家族无法立足）。平时为绑著马尾的男装打扮，实际上是隐形巨乳。
童年时比较懦弱，并受到青梅竹马阿妙的保护，因为保护阿妙且与前来志村家讨债的流氓打架，导致左眼失明，之后一直佩带眼罩，为此苦修剑术，剑术突飞猛进[参11]。被阿妙称呼为“九仔（九ちゃん）”。
虽受男性教育，平时充满男子性格，内心仍有女孩子个性的一面，会想玩家家酒、花绳、打扮、逛街[参72]，或是穿哥特萝莉装[参73]。
对人情世故很不熟悉，会做出很天真的行动。若有男性碰到她，会使用过肩摔甩出去，在作品里除了家人，只有银时可以偶尔免疫其过肩摔。讨厌蕈类，原因纯粹是觉得形状恶心。[参74]
《九兵卫篇》中初登场想要将阿妙娶进柳生家，但后来因为新八、近藤等人的阻止而作罢，正视了自己的性别，但依然保持著对于阿妙的爱慕。
《尾美一篇》中虽对理论上的情敌近藤抱有杀意，但当阿妙的初恋尾美一出现时，两人一度联手合作。
《性转换篇》因一时与非法新兴宗教〈凹凸教〉的教主交集，在意见不一致下引发歌舞伎町性转换事件，同时自己也成为真正的男儿身。后来以男儿身跟阿妙相处的过程里感到犹豫，最后在银子的促使下决定以原来的女儿身讨伐凹凸教。
《人气投票篇》中与其他女角色组成Diamond Perfume，并于《HDZ48篇》中登场帮助寺门通。
《银之魂篇》中以协助者的身份参与两次龙脉战争，结局中不时在妙的夜店里兼职，希望可以减少对男性的抵触。
角色源自于独眼剑豪柳生十兵卫，因此作品设定为女性，故此“十”兵卫-“一”（男性生殖器官）=“九”为此名。
柳生敏木斋（柳生 敏木斎（やぎゅう びんぼくさい），Yagyū Binbokusai）
配音：龙田直树（日本）；陈幼文（台湾）；黄子敬（香港）
5月30日出生，身高88cm，体重24kg。[参75]
柳生家前任当家，九兵卫的祖父。被誉为是柳生家历代当家中最强的剑豪，也是九兵卫的剑术师父。能若无其事吃下阿妙做出的烧焦食物，但之后导致严重腹泻。总是从别的地方捡垃圾回来，所以家里出现了垃圾屋。
性格飘忽不定、难以捉摸，让人不知道他的想法。非常珍视九兵卫。擅用身形瘦小特点的俐落行动，在摆布敌人后再给予猛烈一击。[参75]
《九兵卫篇》中与作为柳生家的大将决战万事屋等人，在厕所心理战里脱颖而出，但于最后大战中被银时和新八的合作打败。
《银之魂篇》中再次出场跟柳生一族对抗天人联军，大展身手。
角色源自于安土桃山时代的剑豪、柳生新阴流的开祖柳生石舟斋[注10]和“寒酸”（貧乏臭い）。
柳生舆矩（柳生 輿矩（やぎゅう こしのり），Yagyū Koshinori）
配音：黑田崇矢（日本）；何志威（台湾）；张炳强（香港）
5月10日出生，身高122cm，体重38kg。[参76]
柳生家现任当家，九兵卫的父亲。执着于守护柳生之剑以及名流血统。宁可忍受过敏之苦也要抱著波斯猫，拼命地要表现出名流的模样。[参76]在作品里没有展露过身手。
对九兵卫如何称呼自己十分在意，常要求九兵卫叫较为西式的“爸爸大人（パパ上）”，而不是传统的“父亲大人（父上）”。
角色源自于德川家康的剑术师范柳生宗矩。
东城步（東城 歩（とうじょう あゆむ），Tōjō Ayumu）
配音：游佐浩二（日本）；江志伦（台湾）；刘昭文（香港）
1月14日出生，身高178cm，体重66kg。[参77]
柳生四天王之首，负责护卫及照顾九兵卫，有容易担心的性格。因为将保护九兵卫视为一生的任务，为了不让她遭遇任何危险而时常做出过火的保护行动，或是匪夷所思的变态行为。无视银时等人和柳生家的死斗等等发生于柳生家的重大事件，只顾写著《少主成长记录》，对九兵卫的爱和变态程度与日俱增。[参77]
实力次于九兵卫，在维持柳生一族的大小事务上深受器重。基本上只有遇到与九兵卫相关的事，才会拔刀。
平时总是眯著眼睛，一旦怒气到达最高点，就会从双眼发射出光线。喜欢跟女孩子洗泡泡浴，是风俗店的常客。
一心朝著让九兵卫喜欢上男人的方向努力，为达目的甚至会不将其他人的安危放在心上，对九兵卫适合穿哥特萝莉装坚信不疑。[参78]对九兵卫的狂热绝对不亚于“近藤勋追求阿妙”和“猿飞菖蒲对银时”。
主线里在《九兵卫篇》中著名的厕所心理战中败北，一直到《银之魂篇》中才再度出场带领四天王对抗天人联军。然而，在日常搞笑里基本只要九兵卫在他就会出场，比其他三人要多得多。
名字源自于《草莓100%》的女主角之一，东城绫。
北大路斋（北大路 斎（きたおおじ いつき），Kitaōji Itsuki）
配音：浜田贤二（日本）；陈幼文（台湾）；翟耀辉（香港）
5月3日出生，身高175cm，体重65kg。[参79]
柳生四天王之一，实力次于东城。对道场剑术怀有骄傲，相信只要比有才能的人更加努力练习，就能在战斗中获胜。因为这个缘故，大量食用原本最讨厌的蕃茄，将蕃茄酱变成喜欢的东西，如此这般地在日常生活中也进行精神上的修炼。此外，还具备能马上看出对手弱点的超群洞察力及冷静判断力，擅长出人意表的攻击。因为生性冷漠，说话不留情面，经常出现和南户斗嘴的场面。透过镜片是细长的眼睛，不载眼镜时眼睛变成鲫鱼眼。[参79]
名字源自于《草莓100%》的女主角之一，北大路五月[注11]。
西野掴（西野 摑（にしの つかむ），Nishino Tsukamu）
配音：园部好德（日语：園部好徳）（日本）；马国尧（台湾）；朱子聪（香港）
9月16日出生，身高208cm，体重113kg。[参80]
柳生四天王之一。与剑术相较，更擅长肉搏战。讲话时都使用谦卑的代称以称呼自己。但是当南户受伤用手机拍照来当作纪念时，又会一边说“幼稚”一边却把提议者推开。拥有不逊于神乐的怪力。还有与他庞大的身躯不符合的特点：似乎喜欢儿童餐，若被吐嘈还会生气。[参80]在《银之魂篇》中与天人大战时被砍掉一只手臂退下火线。
名字源自于《草莓100%》的女主角之一，西野司。
南户粹（南戸 粋（みなみと すい），Minamito Sui）
配音：绿川光（日本）；何志威（台湾）；冯锦堂（香港）
3月31日出生，身高173cm，体重63kg。[参81]
柳生四天王之一。对自己的外表相当有自信（自恋），以美男子自称。穿著随性再加上首饰，与其说是武士更像是个花花公子。似乎擅长对女人花言巧语，安慰了许多曾被阿泷凌虐的女佣。在四天王中经常负责吐嘈，但每次只要吐嘈其他人，就被回敬“脸蛋像生殖器”。虽然带著天下第一的柳生一门光环，但因为怠于锻炼，剑术是四天王中最弱的。[参81]
名字源自于《草莓100%》的女主角之一，南户唯。
泷婆（お滝（おたき），Otaki）
配音：巴菁子（日本）；郭怡心（台湾）；雷碧娜（香港）
12月8日出生，身高124cm，体重28kg。[参76]
长年侍奉于柳生家，负责指导其他女佣。通称“老太婆”（オババ）。擅长整人，只要是有她看不顺眼的佣人，就会想尽办法虐待对方至精神衰弱，不过对志村妙毫无办法。
小屎丸（ビチグソ丸）<简称>
配音：白石凉子（日本）；郭馨雅（台湾）
《寿限无篇》中登场，是微微公主为玩赏而饲养的母猴所生，之后送给了将军的侄子德川盛盛。由于非常顽皮难以管教，因此交给柳生家训练。[参82]好丢粪，尤其是往坂田银时的脸上扔。头脑似乎非常好。非常喜欢九兵卫。被盛盛起名叫悟空后闷闷不乐而失踪。找到之后，盛盛将它送给了九兵卫。[参83]。
名称由来是来至落语的段子“寿限无”：一个和尚帮人家的小孩子取名字，众人纷纷向他介绍吉祥的话语，结果把这些话全部串起来的一个故事。
全名为“寿限无寿限无扔屎机前天小新的内裤新八的人生巴尔蒙克·费扎利昂艾萨克·施奈德三分之一的纯情之感情的剩下三分之二是在意倒刺的感情背叛好像知道我的名字我知道他不知道的不在家干鱿鱼干青鱼子粪坑这个跟刚才的不同哦这个是池乃鱼辣油雄帝宫王木村皇呸呸呸呸呸呸呸呸呸呸呸小屎丸”（原文：「寿限無寿限無ウンコ投げ機一昨日の新ちゃんのパンツ新八の人生バルムンク＝フェザリオンアイザック＝シュナイダー三分の一の純情な感情の残った三分の二はさかむけが気になる感情裏切りは僕の名前をしっているようでしらないのを僕はしっている留守スルメめだかかずのここえだめめだか……このめだかはさっきと違う奴だから池乃めだかの方だからラー油ゆうていみやおうきむこうぺぺぺぺぺぺぺぺぺぺぺビチグソ丸」）。
池田家
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代代担任幕府公仪处刑人的家族，专长于利落的斩断首级。家主之位不是世袭，而是由家中选出剑法最为高强的人担任。家主都会继承夜右卫门之名。
池田朝右卫门（池田 朝右衛門（いけだ あさえもん），Ikeda Asaemon）
配音：井上麻里奈（日本）；吴佳桦（台湾）；曾秀清（香港）
带著骷髅面具的少女，池田家斩首绝技“净灵”的传人。剑术高超，精通断首连皮技巧而被称为“死神”的处刑人。前代・池田夜右卫门的养女，具有优秀的剑术才华。从小与夜右卫门如兄妹般一起长大，两人彼此竞争也彼此激励，希望未来能够一同守护池田家。
原是前代（第十七代）池田夜右卫门选定的继任人，但因发生了前代私放罪犯，亲手为前代介错。后为向幕府隐瞒这件事，自己背上杀师夺位的污名离开了池田家。对身为法律执行者的自己，却杀死相当于自己法律的导师而感到迷惘。由于介错时的犹豫，斩首时产生了失误，认为是自己害了养父，让他的灵魂不会安息。意志消沉下一心求死时遇上银时，要求他为自己介错。
亲生父亲是参与过攘夷战争的攘夷志士。在战争结束后为明哲保身，将同伴出卖给一桥派，甚至到最后还打算献出自己的女儿。幸好这被路过的银时出手阻止，并以束手就擒为代价保下其性命。后来成为池田家养女的朝右卫门遇到身在监狱中的银时，在不知道其实是她救命恩人的情况下，跟银时立下约定，当自己成为了不起的处刑人时，会亲手让他毫无痛苦的死去。所以，不同的角度来说，银时既是朝右卫门的杀父仇人，也是救命恩人。
曾数次斩下银时的乳头。事件结束后表面上为负起事件责任而自杀，实际上继承了池田家主之位，成为第十九代夜右卫门。原型为日本江户时代公家御用的刀剑试斩者，山田家当家代代继承的工作与名字山田浅右卫门。
池田夜右卫门（池田 夜右衛門（いけだ やえもん），Ikeda Yaemon）
配音：千叶一伸、斋藤绫〈少年〉（日本）；麦皓丰（香港）
第十八代池田夜右卫门，前代・池田夜右卫门的亲生儿子。剑术高超，与朝右卫门亲如如兄妹般一起长大，但没有血缘关系。深爱自己的家族和剑术，但只重技巧而没有锻炼心灵，被父亲认为他的剑不能净化人的灵魂而没有传位给他。不过，因前代被私下处决而朝右卫门离开，他也就成为了池田家的首领。
为了让池田家在幕府获得稳固的地位而投靠一桥派，暗中杀死过去在攘夷战争时令一桥派打败仗的攘夷志士。在冲田和土方的搅局下，被银时和朝右门卫合力击败，承认了自己的败北。认为既然自己失败的话，就必须让朝右卫门活下来保护池田家，选择独自留下断后，让银时和朝右门卫他们能顺利撤离。为此，被到来的一桥喜喜给枭首。
前代・夜右卫门
配音：石田圭祐（日语：石田圭祐）（日本）；黄子敬（香港）
前代池田家家主，朝右卫门与夜右卫门的父亲。池田家斩首绝技“净灵”的传人。认为将罪恶深重的鬼在最后还原为人，是自己作为公仪处刑人的职责，绝不扭曲将犯人视为人类的信念。因私放囚犯而被池田家处决。而他之所以这么做，是因为他认为那些人都是政治牺牲品，实际上并无过犯。在被他私放的犯人名单中，就包括银时在内。
捕快
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小钱形平次（小銭形平次（こぜにがた へいじ））
配音：石冢运昇（日本）；陈幼文（台湾）；梁志达→李锦纶（香港）
生日：5月16日（金牛座）；身高1.83米（6英尺0英寸）；体重76千克（168磅）。
自称Hard Boiled捕快（ハードボイルド同心）。总是戴着墨镜、抽着雪茄，以一副十分能干的样子示人，可实际上办事效率极差，常在当值期间到夜店或居酒屋消遣。在初登场篇章里和万事屋一同追捕著他视为劲敌的怪盗“狐狸”，及后真相大白后与其惺惺相惜。
在后面基本只在正篇中才偶尔出场，包括在《四天王篇》中以援军身份助银时对抗人妖和黑帮的联军。在《再见真选组篇》作为土方的现任上司，掩护他和真选组去黑绳岛，并在大战中受伤。于《银之魂篇》中亦奋勇加入对抗天人大军。
角色取材自钱形平次。
小八（ハジ，Hadj）
配音：比嘉久美子（日本）；郭馨雅（台湾）；雷碧娜→何宝珊（香港）
生日：8月5日（狮子座）；身高1.63米（5英尺4英寸）；体重45千克（99磅）。
捕快。小钱形的少女下属兼搭档，年纪比小钱形要小很多，但明显更加可靠。在《四天王篇》、《再见真选组篇》和《银之魂篇》都有跟随小钱形出场。
角色取材自《钱形平次》的八五郎（阿八，ハチ）。
幕府职官
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六转舞藏（六転 舞蔵（ろってん まいぞう），Rotten Maizō）
配音：千叶繁、徳本英一郎〈年轻〉（日本）；陈曙光→朱子聪、邓志坚〈年轻〉（香港）
过去是前任将军德川定定的侧众（日语：側衆），现任工作则是负责教育微微公主，虽然口气严厉，但却是个有著受虐癖的糟老头，特别喜欢别人踢他的屁股，对此公主给他取个讨厌爷(じいや)的绰号。因为茂茂和公主幼年失去双亲时是由他一手带大的，所以很受两兄妹的尊敬。虽然有衣物遮蔽而不明显，于《倾城篇》初登场时他并没有左臂。
是与花魁铃兰订下约定的人，过去作为定定的部下时在樱花树下看见因被定定给利用而伤心落泪的铃兰，过去安慰她并最终与之相爱。然而，碍于身分的缘故两人总是暗中私会，并约定好要在下一个满月之日带铃兰离开吉原。但此事被早已知晓二人关系的定定发现，砍下舞藏的左手臂做为惩戒并且以铃兰的命作为威胁严禁二人见面。舞藏也因为自身对于幕府的忠诚，所以与铃兰的约定一直无法兑现。
在定定嫁祸给银时等人被以要求责任承担为由，命令他切腹，但他并没有跟从。定定因此给砍下其右臂，因失血过多差点丧命。事件结束后在茂茂及银时等人的帮忙下回到吉原，并在当年樱花树种植的地方见到铃兰的最后一面。他也在樱花飞舞的幻想中回到年轻的时期，抱著铃兰走向满月。
《将军暗杀篇》中与公主再次登场，后被服部全藏点穴，并在其面前杀掉影丸。因为自小与茂茂认识，舞藏在离开前便知道死去并非茂茂。与公主等人离开后，送重伤的冲田前往急救。在《再见了真选组篇》和《银之魂篇》均留在公主身边。
名字参考自《小天使》（海蒂）中克拉拉家里的女管家罗曼亚。
禽夜（きんや，Kin'ya）
配音：坂口候一（日语：坂口候一）（日本）；黄干师（台湾）
幕府的高官（官僚）。被真选组称为“蛤蟆（ガマ）”。动画中会在语尾加上“ケロ（Kero）”。把地球人类当成垃圾般下贱，并嘲讽为“猴子（猿）”。电视动画第66话再度登场。跟宇宙海盗“陀络”勾结，协助非法药物的买卖能顺利进行，从中得到部分的收益。因而成为攘夷志士的暗杀目标，故需由真选组保护。但对于冒著生命危险保护自己的真选组，甚至是以身躯掩护自己而受伤的近藤，毫不感激。山崎私自行动于其大屋进行过各种调查，结果在仓库找到大量“转生香”。
远山珍太郎（とおやま ちんたろう，Tōyama Chintarō）
配音：渡部猛（日本）；林保全（香港）
南町奉行所的极悪奉行。为了拿下桂小太郎的人头，从而巩固自己在幕府里的地位，因此故意制造出艾利撒比斯的棉花玩偶，并聘请服部全藏等人，引桂主动现身。
角色取名自《远山的金先生（日语：遠山の金さん）》的远山金四郎。
友之助（とものすけ）
配音：山口惠（日本）
茂茂原家臣，因家人被抓取当人质而被迫刺杀茂茂，后立刻服毒自杀。